1.2.1.2 可溶性蛋白SDS-PAGE凝胶电泳〔8〕 浓缩胶浓度3% ， 分离胶浓度12% ， 含0.1%SDS 。 电泳后 ， 凝胶用0.25%考马斯亮蓝R250、50%甲醇、10%乙酸固定染色6h ， 然后用7%乙酸和15%甲醇脱色 。 胶片用岛津CS-930薄层扫描仪595nm波长扫描 。 分子量测定用低分子量标准蛋白含兔磷酸化酶B(97400 u)、牛血清白蛋白(66200 u)、兔肌动蛋白(43000 u)、牛碳酸酐酶(31000 u) ， 胰蛋白酶抑制剂(20100 u)和鸡蛋清溶菌酶(14400 u) 。
1.2.1.3 可溶性蛋白含量、蛋白酶活性与游离氨基酸测定 可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染料结合法〔6〕 ， 在岛津UV-265分光光度计上测吸光值 ， 并计算蛋白浓度 。 蛋白酶活性测定采用内源基质法〔7〕 。 游离氨基酸含量测定用国标法GB8312-87 。
1.2.2 RuBP羧化酶提取及酶活力测定
1.2.2.1 RuBP羧化酶提取〔4,9〕 鲜叶去叶脉 ， 液氮冷冻24h ， 再保存于-30℃冰柜待用 。 取10g上述保存的材料 ， 加入80ml预冷的新鲜提取液（50mmol／L磷酸缓冲液 ， pH7.4 ， 内含1mmol／L EDTA ， 5mmol／L巯基乙醇 ， 10%甘油) ， 及2g水不溶性PVP ， 预冷的组织捣碎机匀浆 ， 快速5s ， 慢速5s ， 重复3次 。 然后经4层预冷纱布过滤 ， 滤液经11900r／min离心20min ， 收集上清 。
1.2.2.2 RuBP羧化酶活力测定 采用同位素方法测定 。 总体积为800μl的反应混合液含100μmol Tris-HCl缓冲液(pH7.8) ， 10μmol MgCl2 ， 8μmol NaH14CO2 (2μCi) ， 2μmol DTT和100μl上述提取的RuBPcase酶液 。 25℃预温10min使酶活化 ， 加入0.5μmol RuBP使反应开始 。 5min后 ， 加入800μl HCl终止反应,90℃烘箱干燥 。 PACKARD 1900CA双道液体闪烁计数器测定 ， 按以下公式计算酶活力：
U=DPM×3.997×60×V／(2.22×106×5×10-1)(CO2μmol.g-1.h-1FW)
式中：3.997为每微居里(μCi)14C相当于CO2的微摩尔数(μmol)；60为分钟数(min)；V为每克鲜重植物得到的酶液原液的体积(ml)；2.22×106为每分钟内1μCi14C的蜕变数；5为反应时间(min)；10-1为反应体积中酶液的体积(ml) 。
2 结果与分析
2.1 叶片可溶性蛋白的电泳分析
叶片可溶性蛋白组分测定材料为本所苗圃3年生茶苗 ， 自4月9日起每隔一周取样至5月16日叶片复绿时止 。 各时期样品电泳后进行比较 ， 未能发现有明显的组分变化 ， 仅发现有两条带的强度在不同时期有显著差异 。 将电泳胶片在薄层扫描仪上扫描后 ， 其结果(图1)证实这两条带的含量在白化期与复绿后差异较大 。 根椐与低分子量标准蛋白质的对比计算 ， 确定它们的分子量分别为54.2ku和14.9ku左右 。 经与菠菜RuBP羧化酶提纯品的多次比较 ， 确认其为RuBP羧化酶大、小亚基 。 由图1可见 ， 白茶突变体RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化初期与全白期均处于较低水平 ， 复绿后急剧升高 ， 两个亚基的变化幅度基本相近 。
因为安吉白茶突变体原发现于安吉山区一农家茶园 ， 已无法找到产生这一突变体的原茶树种群来作为对照 ， 为确证这种RuBP羧化酶大、小亚基含量的变化确实是与突变体的返白性状有关 ， 而不是叶片本身发育的原因 ， 选择了安吉白茶突变体的种子后代中不表现返白特性的植株作为对照 ， 对比了突变体与其有性后代在各时期RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差别 。 种子后代叶片可溶性蛋白电泳胶片的扫描结果如图2所示 。 根椐电泳图谱的对比 ， 也未能发现白茶突变体与其有性后代在叶片可溶性蛋白组分上有明显差异 ， 但作为对照的突变体有性后代RuBP羧化酶两亚基在各时期的水平基本没有变化 ， 与白茶复绿期水平接近 ， 大大高于白茶返白期水平 。 该结果与对照植株不表现白化突变的现象一致 ， 说明白茶RuBP羧化酶亚基的含量变化确实是由突变引起的 。
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