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1 如果你用了插入片断特异的引物扩增 ， 那么可能是你连接时加的目的片断过多 ， 菌表面粘附了目的片段（我曾经在没有斑的地方蘸一下 ， 也能P出目的带） ， 因此很可能出现假阳性 。这样验证阳性克隆时建议你1〉用插入片断两端的测序引物（如M13F+R） ， 做个PCR ， 看能否扩出目的大小的带 ， 如果有 ， 说明肯定有片断连入T载体；如果能用一个测序引物和一个你自己的引物扩增就更好了 ， 不但可以确定插入的方向还可以肯定是你的片断插入 。2〉可以抽出质粒后 ， 酶切验证（这个最保险）；但是质粒很少时 ， 用你的特异引物 ， 进行较少循环数的扩增 ， 如果能拿到很亮的带 ， 那么很可能是阳性；因为提质粒后蘸附的片断会很少 ， 而质粒作模板有利于目的基因的克隆2 如果你的菌中质粒拷贝数很低 ， 基因组比较复杂（如农杆菌） ， 有时会出现假阴性（不能P出带） ， 这时 。可以提质粒后在PCR验证 。
【关于菌落pcr】
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