什么是引物设计原则,一起来看看小编今天的分享吧 。
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step1: 引物长度一般为15-30bp , 常用的为18-27bp,但不能大于38bp 。
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step2: 引物GC含量一般为40%-60%,以45-55%为宜,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近 。
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step3: 引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右 , 至少要在55-80℃之间,Tm值曲线以选取72度附近为
佳 , 5'到 换段青南3’的下降形状也有利于引物与模板的结合 。
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step4: ΔG值(自由能)反应了引物与模板结合的强弱程度,3'端的ΔG值相对要低 , 且绝对值不要超过9,否则不
利于正确引发反应,3'来自末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时 , PCR产量几乎达到百分之百,但在-6时只达到40% , -8
时少于20%,-10时接近于0 。
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step5: 错配率一般不要超过100 , 否则会出现非目的条带 。但对于某些特定的模板序列,还应结合比较其在正确位
点的引发效率 。如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为340以上,而在错误位点的引发效率为110,并且
不好找到其他更合适的引物,那么这对引物是可以接受的 。
【引物设计原则】
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step6: Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标,解释了序列片段存在的重复几率大小,选取引物时,应该用Frq
值相对较低的片段 。
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step7: 引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5 , 否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从
而导致PCR不能正常发生 。
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step8: 3'端最好不要是连续碱基,G黑机义满叶集在既儿达百GG或CCC会导致错误的引发,同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T,若
是,会导致错配
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step9: 以公式Tm=4*(G随女背+C)+2*(A+T)-5计算Tm值 , 也就是退火温度 。选择较低Tm值的引物的退火温度为
反应的退火温度,最好保证每个引物的Tm值相匹配,且在70-75℃范围内 。
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