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科技名词定义中文名称：等电点 英文名称：isoelectric point 定义：蛋白质或两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，此时蛋白质或两性电解质在电场中的迁移率为零 。符号为pI 。所属学科： 生物化学与分子生物学(一级学科) ；氨基酸、多肽与蛋白质(二级学科) 等电点聚焦测蛋白质等电点一、实验原理等电点聚集实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法 。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性电解载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的PH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的PH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为零的区带，这时的PH则是这种蛋白质的PI 。IEF技术的关键是得到一定范围的稳定的PH梯度 。也即找到合适的两性载体 。二．实验试剂1．丙烯酰胺单体储液 丙烯酰胺[Aa]30%[W/V]，甲叉双丙烯酰胺[Bis]0.8%[W/V]2．核黄素 0.025%[W/V]3．Ampholien PH3.5-9 凝胶工作液 Aa：Bis 1ml甘油 0.25mlAmpholine PH 3.5-9 0.4ml双蒸水 3.25ml摇匀，用水泵抽气10分钟，加入0.025%核黄素0.15ml，摇匀后用滴管灌入玻管中 。4．25%[W/V]蔗糖水溶液，用于配制蛋白样品5．10%蔗糖水溶液，用来铺于样品层上部 。6．电极液： 上槽 0.02M H3PO4 1000ml下槽 0.01M NaOH 600ml7．染色液： 0.01%考马斯亮蓝R-250 5%三氯乙酸5%磺基水杨酸三．实验仪器与器具玻璃管4×120mm 4支封口膜试管架细长滴管注射器及长针头玻片、刀片 10ml玻璃瓶微量可调移液器圆盘电泳槽及电泳仪四．操作步骤1．圆柱体凝胶制备，用封口膜将玻管（4×120mm）的一端封口，将玻管套上橡皮塞，加入凝胶混合液至10cm处，轻轻铺上一层双蒸水，置于日光灯下待其聚合 。2．聚焦电泳（1）将电泳下槽注入0.01M NaOH、将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳槽（注意塞紧所有的孔，以防电极液下露） 。将上槽连同电泳管置于下槽上，此时凝胶下端与电极液接触，注意排除凝胶下表面的气泡 。（2）加样100μl蛋白含量2-5μg 。（3）在样品上轻轻一层10%的蔗糖，直至顶端，作为隔离层 。（4）上槽注入0.02M H3PO4，注意不要搅混样品层和隔离层 。（5）接上电源，正极接酸，负极接碱 。恒定在120V，通电16-18小时至电流降至0为止 。3．蛋白质染色及等电点测定：（1）取胶 将凝胶后的含样品的凝胶借助长注射器针头注水取出 。（2）蛋白样品的染色由于两性载体Ampholine可与多种蛋白染色剂结合，并形成不溶性复合物，因此一般需要染色前除去Ampholine 。本实验直接将凝胶置于三氯乙酸中浸泡，立刻可见蛋白带 。（3）PH梯度测定 取液，分别加入于10只小玻璃瓶中，将欲测的PH梯度的胶条置于玻璃片上，用刀片切成长的小段，按顺序放入有编号的小玻璃瓶中，盖好橡皮塞，将凝胶段在室温下浸泡过夜，次日用PH计测每支小瓶中浸泡液PH值 。将得到的PH值对凝胶长度作图，得标准曲线 。（4）样品的PH值测定 。测定出染色蛋白带的位置，在PH梯度曲线上求出相对应PH值既是此样品的PI 。五．实验结果测定十个小管中胶条的PH分别为7.14、7.86、7.50、6.96、6.38、5.74、5.10、4.49、4.13 。以胶条距碱端的距离为横坐标，PH值为纵坐标作图：经过测量，待测蛋白距碱端为7.3cm，浸泡后胶的总长度为10.5cm，等比例换算得距离应为6.95，带入公式得待测蛋白的PI值为：4.64 查表得知与牛血清白蛋白的等电点接近 。六、讨论1、载体两性电解质含量2％~3%比较适合，能形成好的梯度 。2、制胶用丙稀酰胺最好是重结晶的 。过硫酸铵要新配的 。所有的水都要用重蒸水 。3、样品必须无盐，否则电泳时样品条带可能走歪，拖尾或者根本不成条带 。加样的量要适当，避免过多电泳后条带不清晰 。4、由于碱性漂移作用，胶条碱端最初1cm的pH值过低，故作图时舍去 。（5）本实验结果中同时加入待测和以前提取两种蛋白（未发现条带,可能样品含盐量过大），待测蛋白在三氯乙酸中固定后即可看到明显的白色条带，故未用染色液染色即可测量迁移距离 。
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