微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序 ， 经由过程阐发测序序列的组成阐发特定情况中微生物群体的组成环境或基因的构成以及功能 。 借助分歧情况下微生物群落的组成差别阐发我们可以阐发微生物与情况身分或宿本家儿之间的关系 ， 寻找标记性菌群或特定功能的基因 。 对微生物群落进行测序包罗两类 ， 一类是经由过程16s rDNA ， 18s rDNA ， ITS区域进行扩增测序阐发微生物的群体组成和多样性；还有一类是宏基因组测序 ， 是不颠末分手培育微生物 ， 而对所有微生物DNA进行测序 ， 从而阐发微生物群落组成 ， 基因组成 ， 挖掘有应用价值的基因资本 。
以16s rDNA扩增进行测序阐发本家儿要用于微生物群落多样性和组成的阐发 ， 今朝的生物信息学阐发也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因组成和代谢路子进行展望阐发 ， 大大拓展了我们对于情况微生物的微生态认知 。
今朝我们按照16s的测序数据可以将微生物群落分类到种（species）（一般只能对部门菌进行种的判定） ， 甚至对亚种级别进行阐发 ，
几个概念：
16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因 ， 长度约为1542bp ， 其分子大小适中 ， 突变率小 ， 是细菌系统分类学研究中最常用和最有效的标记 。 16S rRNA基因序列包罗9个可变区和10个保守区 ， 保守区序列反映了物种间的亲缘关系 ， 而可变区序列则能表现物种间的差别 。 16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为本家儿,焦点是研究样品中的物种分类、物种品貌以及系统进化 。
OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培育阐发中经常用到 ， 经由过程提取样品的总基因组DNA ， 操纵16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR扩增 ， 经由过程测序今后就可以阐发样品中的微生物多样性 ， 那怎么区分这些分歧的序列呢 ， 这个时辰就需要引入operational taxonomic units ， 一般环境下 ， 若是序列之间 ， 好比分歧的 16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把它界说为一个OTU ， 每个OTU对应于一个分歧的16S rRNA序列 ， 也就是每个OTU对应于一个分歧的细菌（微生物）种 。 经由过程OTU阐发 ， 就可以知道样品中的微生物多样性和分歧微生物的品貌 。
测序区段：因为16s rDNA较长（1.5kb） ， 我们只能对此中经常转变的区域也就是可变区进行测序 。 16s rDNA包含有9个可变区 ， 别离是v1-v9 。 一般我们对v3-v4双可变区域进行扩增和测序 ， 也有对v1-v3区进行扩增测序 。
需要这些哦
16s rDNA测序起首需要提取情况样品的DNA ， 这些DNA可以来自泥土、粪便、空气或水体等任何来历 。
提取DNA后需要颠末质检和纯化 ， 一般16s rDNA测序扩增对DNA的总量要求并不高 ， 总量大于100ng ， 浓度大于10ng/ul一般都可以知足要求 。 若是是来自和寄本家儿共生的情况如虫豸的肠道微生物 ， 提取时可能包罗了寄本家儿自己的大量DNA ， 对DNA的总量要求会提高 。 微生物菌群多样性测序受DNA提取和扩增影响很大 ， 分歧的扩增区段和扩增引物甚至PCR轮回数的差别城市对成果有所影响 。 因而建议统一项目分歧样品的都采用不异的前提和测序方式 ， 这样彼此之间才存在可比性 。
完当作PCR之后的产品一般可以直接上测序仪测序 ， 在上机测序前我们需要对所有样本进行定量和均一化 ， 凡是要进行荧光定量PCR 。 完当作定量的样品夹杂后就可以上机测序 。
16s rDNA测序今朝可以采用多种分歧的测序仪进行测序 ， 包罗罗氏的454 ， Illumina的Novoseq, MiSeq ， Hiseq ， Life的 PGM 或 Pacbio 以及 nanopore 的三代测序仪 。 分歧的仪器各有优错误谬误 ， 今朝最本家儿流的是Illumina公司的MiSeq ， 因为其在通量、长度和价钱三者之间最为均衡 。 MiSeq 测序仪可以发生 2x300 bp 的测序读长 ， Hiseq 和 Novoseq 可以生当作 2x250bp 或者 2x150bp 的测序读长 ， 且通量较大 。
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