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PCR引物设计的11条黄金法则
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计 。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的 。在NCBI上搜索不同物种的同一基因 ， 通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment） ， 各基因相同的序列就是该基因的保守区 。
2.引物长度一般在15~30碱基之间 。引物长度（primerlength）常用的是18-27bp ， 但不应大于38 ， 因为过长会导致其延伸温度大于74℃ ， 不适于TaqDNA聚合酶进行反应 。
3.引物GC含量在40%~60%之间 ， Tm值最好接近72℃ 。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应 。上下游引物的GC含量不能相差太大 。另外 ， 上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度 ， 即在一定盐浓度条件下 ， 50%寡核苷酸双链解链的温度 。有效启动温度 ， 一般高于Tm值5~10℃ 。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值 ， 则有效引物的Tm为55~80℃ ， 其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳 。
【PCR引物设计应遵循哪些原则】4.引物3′端要避开密码子的第3位 。如扩增编码区域 ， 引物3′端不要终止于密码子的第3位 ， 因密码子的第3位易发生简并 ， 会影响扩增的特异性与效率 。
5.引物3′端不能选择A ， 最好选择T 。引物3′端错配时 ， 不同碱基引发效率存在着很大的差异 ， 当末位的碱基为A时 ， 即使在错配的情况下 ， 也能有引发链的合成 ， 而当末位链为T时 ， 错配的引发效率大大降低 ， G、C错配的引发效率介于A、T之间 ， 所以3′端最好选择T 。
6.碱基要随机分布 。引物序列在模板内应当没有相似性较高 ， 尤其是3’端相似性较高的列 ， 否则容易导致错误引发（Falsepriming） 。降低引物与模板相似性的一种方法是 ， 引物中四种碱基的分布最好是随机的 ， 不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在 。尤其3′端不应超过3个连续的G或C ， 因这样会使引物在GC富集序列区错误引发 。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列 。引物自身不应存在互补序列 ， 否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性 。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合 。引物自身不能有连续4个碱基的互补 。两引物之间也不应具有互补性 ， 尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成 。引物之间不能有连续4个碱基的互补 。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话 ， 应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol） 。否则易导致产生引物二聚体带 ， 并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行 。
8.引物5′端和中间△G值应该相对较高 ， 而3′端△G值较低 。△G值是指DNA双链形成所需的自由能 ， 它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性 ， △G值越大 ， 则双链越稳定 。应当选用5′端和中间△G值相对较高 ， 而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物 。引物3′端的△G值过高 ， 容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应 。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰 ， 而3′端不可修饰 。引物的5′端决定着PCR产物的长度 ， 它对扩增特异性影响不大 。因此 ， 可以被修饰而不影响扩增的特异性 。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等 。引物的延伸是从3′端开始的 ， 不能进行任何修饰 。3′端也不能有形成任何二级结构可能 。
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