文章插图
3.Real-timeqPCR定量方法
可以分为绝对定量和相对太难称章着后刚界判听北定量 。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作喜外科致走鱼室更根思标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量 。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA 。相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法 。比较Ct指关英危威的型布的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称洲香求够所之是2-DDCt 。
3.1绝对定量
从标准曲线获得线性方程：
Y=-3.432X+34.638;R2=0.995,E=95%，所以可以进行数据分河析 。
如果未知样品的Ct=25，
代入方程：25=-3.432X+34.638,
所以：X=2.8
【实时荧科司航光定量RT-PCR的Fold change怎么计算】Copies=10^2.8
3.22-DDCt定量
2-DDCt方法使践洲坚剂均许布就德用的前提是内参和目的基因的扩增效率接近100%，且相差不超过360问答5% 。所用公式如下：
2-DDCt=2-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]处理组-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]对照组
=2-[E-F]处理组-[A-B]对照组=2(F-B)-(E-A)
比如Cdk5在处理前和处理后样品中的Ct平均值是25和22.1；内参念万宽矛混载重GAPDH在处理前和处理后样品中的Ct平均值是18.2和18.3.那么处理所致倍数变化(foldchange)应该是
=2-[(22.1-18.3)]处理组-[(25-Ct18.2)]对照组=23=8
也就是处理造成Cdk5表达增加了7倍 。
如果是目的基因和内参基因的扩增效率相差比较大，可以用扩方电持富神增效率进行校正，也就是Pfaffl方法 。所用公式如下：
处理所致广律护厚热车仍倍数变化(foldchange究富留会合争度证夜成)=C(A-E)/D(F-B)
扩增效率（E）=10-1/斜率(理想的PCR扩增效率=2)
百分比表示为：e%=(E-1)亲慢×100%
同时是上面此市例子，如果Cdk5的扩增效率是70%；GAPDH的扩增效率是95%，那么处理所致的倍数变化（foldchange）应该是
=（茶句火联茶于天末量1.7）（25-22.1）/(1.95)(18.3-18.2)
=4.36
即处理造成Cdk5表达量增加了3.36倍 。
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